16/06/2015

Complessivamente, circa il 75% della popolazione mondiale, perdono l'attività enzimatica della lattasi dopo lo svezzamento. In Italia il 70% degli italiani adulti non digerisce il latte a causa di un difetto genetico. Tutti nascono con un enzima (lattasi) che "digerisce" il lattosio contenuto in latte e latticini. Un difetto genetico provoca però con l'invecchiamento una progressiva riduzione della sua attività. In molti casi si può arrivare ad una vera e propria intolleranza con diarree e gonfiori intestinali. Non è un fenomeno del "tutto o nulla", piccole quantità di lattosio (20 gr) possono non dare problemi, 30 scatenano problemi intestinali.

La BGT per ovviare almeno in parte, al disagio alimentare delle persone che hanno difficoltà a digerire lo zucchero lattosio presente nel latte e in suoi derivati. ha condotto una attività di ricerca per lo studio e la messa a punto di una tecnologia per la produzione su scala industriale di uno o più enzimi di origine microbica, in grado di idrolizzare lo zucchero lattosio presente nella dieta umana. L'obiettivo realizzativo del progetto è consistito nella costruzione di un sistema vettore/ceppo ospite per la produzione efficiente di enzima β-galattosidasi ricombinante, da impiegare come integratore alimentare.

Parte integrante dell'obiettivo è stata la realizzazione di un laboratorio qualificato e dotato delle attrezzature e strumentazioni necessarie per il clonaggio molecolare di geni in ospiti microbici, per l'analisi dei prodotti e per l'ottimizzazione dell'espressione su scala di laboratorio.

All'unico obiettivo sono corrisposte due attività.

Per mezzo dell'analisi bioinformatica di banche dati, è stato scelto il gene da impiegare nel progetto. Alla base della scelta sono stati individuati i seguenti elementi: l'enzima β-galattosidasi costituito da un'unica catena polipeptica, efficiente nella sua attività verso il lattosio con note caratteristiche di stabilità al calore e al pH; il gene a sequenza nota, per poterlo amplificare con facilità; assenza di introni nella regione codificante. Successivamente il gene prescelto è stato amplificato mediante PCR dal DNA cromosomico del ceppo prescelto. I primer per l'amplificazione sono stati disegnati sulla base della sequenza nota e il prodotto della reazione è stato clonato nei vettori di espressione. Sono stati sperimentati vettori di espressione della serie pET (Novagen) e della serie pTrc (Invitrogen), di cui è nota e ampiamente sperimentata la buona efficienza di espressione. In entrambi i vettori plasmidici il gene esogeno è stato espresso a partire da un promotore inducibile con IPTG, e quindi facilmente controllabile. I plasmidi ottenuti sono stati controllati, determinando la sequenza nucleotidica del gene clonato. La presenza e l'espressione del gene codificante la β-galattosidasi è stato, in un primo tempo, evidenziato per mezzo della colorazione azzurro-blu delle colonie di E.coli su piastre contenti l'indicatore X-gal.

Nella seconda attività sono stati analizzati i parametri per una espressione ottimale della β-galattosidasi, in condizioni di laboratorio. In particolare si sono studiate le condizioni di temperatura, pH, areazione, tempo di induzione con IPTG, tempo di incubazione. La β-galattosidasi misurata in vitro con saggi standard. Le proteine sono state quantificate con il metodo di Bredford (BioRad). Il livello di espressione della β-galattosidasi oltre che da saggi enzimatici è stato valutato anche per mezzo di elettroforesi in gel di acrilamide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) ed eventualmente in condizioni native. L'enzima è stata anche identificato per mezzo della determinazione della sequenza degli aminoacidi della regione N-terminale, effettuata su preparazioni parzialmente purificate, soggette ad elettroforesi e trasferite su opportuno supporto per la determinazione automatica della sequenza secondo il metodo di Edman. Si è inoltre determinata l'effettiva concentrazione di β-galattosidasi in altri prodotti già presenti in commercio.

Il prodotto creato va molto bene per la produzione industriale di latte delattosato, il livello di acidità è perfettamente compatibile con l'enzima trovato.

Il progetto è stato svolto in collaborazione con l'Università di Pavia Dipartimento Genetica e Microbiologia sotto la responsabilità del Prof. Alessandro Galizzi Professore Ordinario di Genetica dei Microrganismi (Pavia).